EP0402 Taq ДНК-полимераза (рекомбинантная), 500 e.a.,Thermo Fisher Scientific

Концентрация фермента – 5 е.а./мкл.

В упаковку также входят:

10X буфер Taq с KCl
10X буфер Taq с (NH4)2SO4
25 мМ раствор MgCl2

Taq ДНК-полимераза – термостабильная полимераза из термофильной бактерии Thermus aquqticus. При инкубировании фермента при 95 °С в течение 40 мин его активность снижается только в 2 раза. Taq ДНК-полимераза катализирует синтез ДНК в направлении с 5'- на 3'-конец. Фермент не обладает детектируемой корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, но имеет дезоксинуклеотидилтрансферазную активность. Это приводит к присоединению дополнительного остатка dA на 3'-конец продукта ПЦР.

Рекомбинантная Taq ДНК-полимераза выделена из клеток E. coli, в которые трансформирована плазмида, содержащая ген pol из клеток Thermus aquqticus YT1. Молекулярная масса мономера фермента 94 кДа.

Рекомбинантная Taq ДНК-полимераза идеально подходит для синтеза методом ПЦР фрагментов длиной до 5000 звеньев с геномной и 10000 звеньев с вирусной ДНК. В качестве субстратов этого фермента могут выступать трифосфаты практически всех модифицированных нуклеозидов (например, содержащие биотин, дигоксигенин, флуоресцентные метки). Точность ПЦР с помощью Taq полимеразы определяется как среднее число правильных нуклеотидов, встроенных в растущую цепь ДНК до появления ошибки, и составляет 4,5 х 104.

Области применения рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы:

Амплификация методом ПЦР;
Получение продуктов ПЦР для ТА-клонирования;
Введение метки в ДНК;
Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

За единицу активности рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы принимают количество фермента, необходимое для включения 10 нмоль дезоксирибонуклеотидов в ДНК-фрагмент, иммобилизованный на носителе DE-81, за 30 мин при 70 °С. Исследование ферментативной активности проводят в 67 мМ Трис-HCl буфере (рН 8,8 при 25 °С), содержащем 50 мМ NaCl, 6,7 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,75 мМ активированную ДНК из молоки лосося, 0,2 мМ раствор каждого из dNTP и 0,4 МВк/мл [3H]dTTP.

Буфер для хранения рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы:

20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 100 мМ КCl, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% (v/v) нонидета Р40 , 0,5% (v/v) твина 20, 50% глицерина.

Условия хранения: -20 °С.

10X буфер Taq с KCl: 100 мМ Трис-HCl (рН 8,8 при 25 °С), 500 мМ КCl, 0,8% (v/v) нонидета Р40.

10X буфер Taq с (NH4)2SO4: 750 мМ Трис-HCl (рН 8,8 при 25 °С), 200 мМ (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твина 20.
Этот буфер позволяет проводить ПЦР в широком диапазоне концентраций ионов магния и избежать неспецифической гибридизации праймеров к ДНК. Для проведения ПЦР на микрочипах рекомендуется использовать 10X буфер Taq без детергентов (В55): 100 мМ Трис-HCl (рН 8,8 при 25 °С), 500 мМ КCl.

Внимание! Ингибиторами рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы являются ионные детергенты - дезоксихолат натрия, саркозил и додецилсульфат натрия - в концентрациях выше, чем 0,06, 0,02 и 0,01% соответственно. Фермент удаляется экстракцией смесью фенол/хлороформ.

Рекомендуемый протокол проведения ПЦР:

Все растворы после размораживания тщательно перемешать и осадить капли быстрым центрифугированием.
Поместить тонкостенные пробирки для ПЦР в баню со льдом.
Приготовить стоковую смесь, состоящую из воды, буфера, трифосфатов нуклеотидов, праймеров и полимеразы. (Объем стоковой смеси рассчитывается исходя из числа реакций плюс ещё одна реакция для уменьшения ошибки эксперимента, связанной с ошибкой пипетки).
Отобрать аликвоты и добавить ДНК-матрицу.
Объем смеси для одной реакции – 50 мкл.
Состав реакционной смеси:
10X буфер Taq – 5 мкл
смесь dNTP, содержащая 2 мМ раствор каждого из нуклеозидтрифосфатов (R0241) – 5 мкл
прямой праймер – 0,1-1 мкМ
обратный праймер – 0,1-1 мкМ
25 мМ MgCl2 (R0971) – 1-4 мМ
ДНК-матрица – 10 пкг-1 мкг
рекомбинантная Taq ДНК-полимераза – 1,25 е.а.
вода без нуклеаз (R0581) – до 50 мкл.
Объём реакционной смеси может быть изменен, но концентрации компонентов должны оставаться теми же.

Перемешать образцы и осадить капли.